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「学术论文」微量精准检测革命性的技术丨应用于HBV和HIV核酸检测

2019年01月22日

应用于乙肝和艾滋病核酸微量精准检测技术原理及临床应用


导读


随着分子生物学技术的不断更新和发展,分子诊断的方法成为一项革命性的技术。特别是基于聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)的分子诊断法,因具有快速、灵敏、特异等显著特点,已成为病原体核酸检测的新标准。


核酸检测技术的开展大大提高了疾病的诊断效率和准确率,同时为临床治疗的监测提供了快速、准确的方法,很大程度上弥补了传统检测方法的不足。目前,核酸检测已在国内外医院、检测机构、实验室等多种平台普遍开展使用。核酸检测包括定性检测和定量检测,定性检测多适用于疾病的诊断过程,而定量检测则普遍适用于疾病诊断和治疗监测的各个环节。核酸定量检测可以通过多种技术手段来完成,其中最为常用的是实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,q-PCR)检测技术,该技术也是医学界公认的扩增效率高、灵敏度高、稳定性好、重复性好的先进的艾滋病检测方法。


实时荧光定量PCR检测技术的原理


q-PCR检测技术是一种实时监控核酸扩增的技术,通过在PCR反应体系中加入荧光染料,利用荧光信号的变化对PCR过程进行实时监控,以此实现对初始模板的定量分析。


图1 PCR过程中荧光信号的积累

图1 PCR过程中荧光信号的积累


1.数学原理


PCR曲线有两种表现形式:线性图谱和对数图谱。


图2 扩增图谱与扩增阶段

图2 扩增图谱与扩增阶段


PCR扩增经历四个阶段,依次为基线期、指数增长期、线性增长期和平台期。扩增产物遵循理论方程:Y=X(1+E)n(Y=扩增产物,X=起始浓度,E=扩增效率,n=循环数)。


PCR扩增结束后,根据Ct值和初始浓度的线性方程式Ct=-klgX0+b,计算被测样本中核酸的初始浓度。


图3 起始浓度与Ct值的关系图

图3 起始浓度与Ct值的关系图


注:Ct值代表样本扩增曲线中,从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数。


2. 化学原理


在q-PCR扩增中,最常用的荧光标记方法有两种:荧光染料法和TaqMan探针法。

荧光染料:最常用的荧光染料是SYBRGreen I。SYBRGreen I是一种DNA小沟结合染料,与双链DNA(dsDNA)特异性结合后,荧光信号会大幅度增强。


图4 PCR扩增与荧光信号的收集(染料法)

图4 PCR扩增与荧光信号的收集(染料法)


绘制出荧光信号增强的曲线图,与标准核酸荧光信号的曲线比较分析进行定量。其缺点在于该染料可能与非特异性的双链DNA(如反应的引物二聚体)结合,对实验结果产生干扰。因此,在体外诊断领域应用较少。


TaqMan探针:是一种水解型探针。通过TaqMan酶在特异性引物上增加一条荧光双标记的探针,分别标记有荧光信号基团R(Reporter)和淬灭基团Q(Quncher),当探针上的R基团和Q基团都存在时不发出荧光信号。在PCR的反应过程中,TaqDNA聚合酶的5’-3’外切酶活性将探针的碱基水解,R基团和Q基团分离,R基团随即发出荧光信号。


图5 PCR扩增与荧光信号的收集(探针法)

图5 PCR扩增与荧光信号的收集(探针法)


随着模板扩增,特异性的DNA数量呈几何级增加,积累荧光的信号也越来越强。通过对荧光信号的检测以及荧光信号曲线的绘制,完成被测样本中核酸的定量检测。


应用


q-PCR的应用范围很广泛,可用于生命科学的各个领域,例如定量分析各种基因的表达分析,基因突变和多态性分析;在生物医疗领域,可用于遗传病诊断、肿瘤用药指导、病原体检测、耐药性分析等,显示出了广阔的应用前景。


基于自主专利技术改进的实时荧光定量PCR检测技术,海善时目前已开展了多项与重大传染疾病相关的核酸检测业务(具体项目如表),以特异性引物、探针、优化的扩增体系、配套优化的核酸提取方法、对检测对象的前瞻性认识、以及专业的检测团队为特点,在目前的核酸检测市场占有绝对的竞争优势。


海善时核酸检测业务


上表中列出了海善时开展部分核酸检测业务,各大合作医院、机构对于试剂的检测性能表示肯定。除以上检测项目外,自主研发的结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)已完成注册审批,肿瘤miRNA的相关研究仍在进行中。


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